Съдържание
- Откриване чрез промяна на цвета
- Използване на ELISA четец за измерване
- Директна конкурентна ELISA (цитохром с)
- Инкубирайте първичното антитяло в епруветки
ELISA тестът е ензимно-свързан имуносорбентен анализ, който използва антитела или антигени, свързани с определен ензим, за да се определи концентрацията на антитяло или антиген. Ако приемате ELISA и не можете да използвате специфични антитела за постигане на вашите резултати, се предлага конкурентна ELISA, защото използва антиген, конюгиран с ензим, вместо антитялото и различен метод за откриване.
Откриване чрез промяна на цвета
Общ протокол за конкурентната ELISA е използването на немаркирани и пречистени първични антитела. Антитялото покрива ямките на микротитърна плака и се инкубира с неизвестни стандарти. След това се добавя имуноген за конюгиране с първичното антитяло, което ще се свърже с местата на антитялото, които все още не са заети. След това се използва субстрат за създаване на промяна на цвета за измерване на свързващата концентрация.
Използване на ELISA четец за измерване
Използвайте микротитърна полистиролна плака и добавете първичното антитяло към всяка ямка. За да се постигне максимално свързване, запълнете ямката с един микрограм от антитялото. Плаката се инкубира в продължение на четири часа при стайна температура. Добавете първичното улавящо антитяло и измийте ямките с PBS (фосфатно буфериран физиологичен разтвор). Инкубирайте плаките с блокиращ буфер за два часа при стайна температура. Пробийте ямките два пъти отново с PBS и добавете стандартите. Поставя се антиген-конюгатният разтвор в ямките и се инкубира отново за два часа. Плаката се промива отново с PBS четири пъти. Добавя се субстрата и се измерва плътността на специфичната дължина на вълната, като се използва ELISA четец.
Директна конкурентна ELISA (цитохром с)
За директна конкурентна ELISA, трябва да се извърши анализ на разреждането на серума за антигена, който използвате в експеримента. След това микротитърната плака се покрива с цитохром с и се инкубира в продължение на една нощ. След това ELISA частта от анализа се извършва чрез добавяне на блокиращ реагент и вторично антитяло. Резултатите от абсорбцията се отчитат с четец на микроплаки.
Инкубирайте първичното антитяло в епруветки
При тази процедура първичното антитяло се инкубира в епруветки, в които се свързва антигенът, който ни интересува. След това пробите се добавят към ямките на микротитърните плаки и се инкубират. След това ямките се промиват за отстраняване на всички несвързани комплекси антиген-антитяло и след това се добавя блокиращият разтвор, за да се предотврати свързването на второто антитяло с ямките. След това вторичното антитяло се отчита на четящо устройство за плаки, за да се получат резултатите.