Отстраняване на неизправности при гел електрофореза

Видео: Фары перестанут потеть если сделать это!

Съдържание

инструкции
съвети
предупредителен
Какво ви трябва

Електрофореза с полиакриламиден гел или PAGE е техника, използвана за разделяне на органични молекули в биологична проба. Молекулите с по-малък размер и тегло мигрират по-бързо в полиакриламиден гел, когато се прилага електрически ток. Обикновено различни наблюдателни ленти се наблюдават след като завършеният гел се инкубира на място. Това е сравнително прост метод. Обаче, липсата на ленти, ивици, които са замъглени или които не са ясни, могат да означават проблем в една или повече стъпки на метода. Трябва да следвате основните насоки за решаване на проблемите на метода на гел-електрофореза, при които резултатите не са според очакванията.

инструкции

Гел-електрофорезата е обичаен метод за отделяне на протеинови или ДНК проби (Jupiterimages / Comstock / Getty Images)

Започнете с последната стъпка на гел електрофореза и работете със задна дата. За гел електрофореза, последният етап е процедурата за оцветяване, използвана за наблюдение на ленти от проби. По време на процеса на оцветяване в действителност трябва да има малко проблеми. Въпреки това, багрилото трябва да бъде добре разтворено в подходящия буфер, преди да се използва за оцветяване на гела. Проверете дали е използвана правилната концентрация на багрилото.
Проверете източника на захранване. Отсъствието на ленти може да означава, че конфигурацията на тока или напрежението е твърде висока и тестовите проби мигрират от гела. Високите настройки също могат да доведат до прекалено бързо преминаване на компонентите на пробата през гела, което води до лоша резолюция и неясни ленти. Пробите може да не мигрират през гела, ако конфигурацията на захранващия източник е ниска. Пробите могат също да се натрупват в ямката, където те са натоварени и да не мигрират през гела.
Проверете течния акриламид, използван за превръщане на полиакриламидния гел. Обикновено процентът акриламид, използван за превръщане на полиакриламиден гел, варира от 5% до 15%. Пробите, съставени от по-големи молекули, се зареждат върху 5% гел, тъй като големите фрагменти се движат по-бавно в гела с по-висок процент акриламид. Малки молекули се зареждат в по-висок процент гел, защото ниската концентрация на гел не би могла да обработва по-малки проби.
Проверете реактивите, използвани за полимеризация на акриламида. Полиакриламиден гел се образува чрез полимеризация на течна смес, състояща се от бис-акриламид и акриламид. Към акриламида се прибавят амониев персулфат и TEMED, за да се катализира образуването на гел. Обикновено акриламидът трябва да показва признаци на полимеризация (образуване на гел) 15 минути след добавяне на амониев персулфат и TEMED. Полимеризацията, която настъпва много бързо, е резултат от големи количества амониев персулфат. Когато е недостатъчно, може да причини непълна или неравномерна полимеризация.
Потвърдете количеството заредени проби. Високите концентрации на пробата могат да се движат бавно през гела и да намаляват разделителната способност на лентата. Ниската концентрация на пробата може да не се наблюдава след оцветяване на гела. Тези багрила представляват ограничения за минималното количество проба, което може да се визуализира в резултат на цветовата чувствителност.
Потвърдете качеството на заредените проби. Солите и другите замърсители, присъстващи в пробата, могат да повлияят на движението на пробата по гела. Електрофорезата е резултат от преминаване на електрически ток през гел, съдържащ токопроводим токов буфер; високи концентрации на соли в пробата могат да повлияят на движението на този ток през гела. Когато се изолира проба, трябва да се включи комплект за пречистване, за да се получи относително чиста проба.
Прегледайте литературния или писмения протокол, за да определите дали е използван правилният "PAGE" за извършване на експеримента. Процентът на акриламид в "PAGE" е специфичен за размера на пробата, която ще се тества. Литературата може също така да предостави конкретна информация относно установяването на енергийния източник и скоростта на миграция на пробата.

съвети

Предоставените насоки са общи за приложения в биологичните изследвания.
При решаването на всяка лабораторна процедура най-добре е да се започне с последната стъпка и да се работи със задна дата, за да се определи проблемът.

предупредителен

Когато работите с акриламид и полиакриламид, носете ръкавици. Акриламидът е невротоксичен реагент и може да се абсорбира през кожата. Полиакриламидът не е невротоксичен, но често съдържа неполимеризиран акриламид и все още може да се счита за токсичен.